Tipos de fluorescência Microscópios

Quando microscópios foram inventados por volta de 1600 dC, filósofos naturais voltaram os olhos para um mundo dentro de um mundo. Quando Antony van Leeuwenhoek trabalhada lentes pequenas , altamente curvas e um suporte mecânico para ajustar o ponto de vista , ele abriu uma janela para o mundo microscópico das bactérias , células sanguíneas , protozoários e da estrutura celular das plantas. Mas ao longo da história da microscopia , houve sempre uma pergunta: O que são essas coisas estranhas visto através de uma lente ? A microscopia de fluorescência refere-se a um conjunto de técnicas que minimizem essa incerteza - porque, em microscopia de fluorescência quando a luz brilha sobre uma amostra , brilha a sua própria luz de volta. Epifluorescência
epifluorescência microscópios brilhar e coletar a luz através das mesmas óptica.

De longe o microscópio de fluorescência mais comum é a configuração de epifluorescência . Em um microscópio de epifluorescência , uma fonte de luz - normalmente uma lâmpada de mercúrio ou xenônio - brilha através de um filtro que seleciona uma região estreita de comprimentos de onda. A luz filtrada brilha sobre a amostra através da lente objectiva de microscópio . A luz que entra é absorvida pelo fluoróforos - Rótulos moleculares que emitem luz de um longo comprimento de onda , quando eles absorvem a luz de um comprimento de onda mais curto . Luz dos fluoróforos , juntamente com a luz difusa da fonte de iluminação, volta para a lente objetiva e para o detector ou olho. Ao longo do caminho , um outro filtro bloqueia a luz de iluminação , por isso, tudo o que resta é a luz fluorescente da amostra.
Confocal

Um microscópio de epifluorescência, recolhe a luz de toda a parte no interior do campo de visão do microscópio . Uma parte da luz de excitação é absorvida antes do plano focal do microscópio , alguns no plano focal e algum para além do plano focal . Porque o microscópio recolhe tudo o que luz , a imagem irá conter uma imagem nítida de luz no foco , mas também terá a luz fora de foco de outras regiões. Um microscópio confocal fixa que, ao focar um raio laser no mesmo plano que o microscópio seja focalizado . Então , um orifício vai em frente do detector , onde bloqueia toda a luz que não provêm da focagem do microscópio . Ao digitalizar a amostra , uma imagem do objeto limpo tridimensional pode ser obtida.
Multiphoton
em um microscópio fluorescente a luz vem de moléculas dentro da amostra.

um microscópio confocal o alinhamento é muito sensível. Se o ponto de laser , a objetiva do microscópio , as ópticas coleta eo pinhole está fora até mesmo a menor quantidade que o desempenho microscópio sofre. Um microscópio multiphoton contorna este problema, usando um comprimento de onda de laser que é apenas metade tão enérgico como ele precisa ser para excitar os fluoróforos presentes na amostra. A única maneira de os fluoróforos vai ficar animado e emitem fluorescência é se a luz do laser é brilhante o suficiente para que duas partículas de luz - fótons - atacar o fluoróforo em um tempo muito curto. Isso acontece apenas quando o laser é focado para uma muito pequena mancha . Assim, o único lugar na amostra que emite luz é onde o laser é focalizada , o que mantém a imagem agradável e limpo , porque não há luz de fundo extra para se livrar de - . Que significa que não pinhole para alinhar

total Internal Reflection fluorescência ( TIRF )
Uma única amostra pode ter vários fluoróforos .

Outra maneira de obter imagens muito limpas é para garantir que a luz de excitação não ir muito longe na amostra. Se uma gota de neurônios , por exemplo , é colocada em uma gota de solução numa lâmina de vidro , em seguida, alguns dos neurónios irá aderir à superfície do vidro . Em uma reflexão interna total de fluorescência ( TIRF ) microscópio a luz é dirigida lateralmente para a lâmina de vidro para que ele não realmente fazê-lo na solução segurando as células. Mas uma parte da luz apenas mal vaza para dentro da solução - só muito perto da superfície do vidro . Isto significa que os únicos lugares que emitem luz estará em uma região muito fina até contra a superfície de vidro . Para algo como neurônios, onde tanta coisa interessante acontece na superfície das células , essa técnica pode ser muito eficaz
Super- Resolution

Todos os microscópios. - incluindo microscópios de fluorescência - estão limitados pela física que governa a propagação da luz . Uma das regras básicas é que um ponto de luz focalizado só pode chegar tão pequeno - e não menor . Para a luz visível, que o tamanho é de cerca de 200 nanômetros ou 200 bilionésimos de metro . Mas moléculas individuais são apenas alguns nanômetros de tamanho , por isso há muitas características interessantes que estão abaixo desse limite de tamanho , o chamado limite de difração . Os cientistas estão desenvolvendo técnicas de " super-resolução " para burlar esse limite. Microscopia de microscopia de iluminação estruturada ( SIM) e estimulou a depleção de emissão ( STED ) , por exemplo , são os dois métodos de microscopia de fluorescência , que limitam o tamanho da mancha de luz emissor por diminuir o tamanho da mancha de luz de excitação .