Quando os microscópios foram inventados por volta de 1600, filósofos naturais voltaram seus olhos para um mundo dentro do mundo. Antony van Leeuwenhoek, ao criar lentes pequenas e altamente curvadas com suporte mecânico para ajuste, abriu uma janela para o mundo microscópico de bactérias, glóbulos sanguíneos, protozoários e estrutura celular de plantas. Mas ao longo da história da microscopia, sempre houve uma pergunta: "O que são essas coisas estranhas vistas através de uma lente?" A microscopia de fluorescência refere-se a um conjunto de técnicas que minimizam essa incerteza — porque na fluorescência, quando a luz incide sobre a amostra, ela devolve sua própria luz.
De longe, o microscópio de fluorescência mais comum é a configuração de epifluorescência. Nele, uma fonte de luz — tipicamente lâmpada de mercúrio ou xenônio — brilha através de um filtro que seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda. A luz filtrada incide sobre a amostra através da objetiva. A luz incidente é absorvida por fluoróforos — marcadores moleculares que emitem luz de comprimento de onda maior quando absorvem luz de comprimento de onda menor. A luz dos fluoróforos, junto com a luz dispersa da fonte, volta pela objetiva para o detector ou olho. No caminho, outro filtro bloqueia a luz de iluminação, restando apenas a luz fluorescente da amostra.
Um microscópio de epifluorescência coleta luz de todo o campo de visão. Parte da luz de excitação é absorvida antes do plano focal, parte no plano focal e parte além. Como o microscópio coleta toda essa luz, a imagem conterá uma imagem nítida da luz no foco, mas também luz fora de foco de outras regiões. Um microscópio confocal corrige isso focalizando um ponto de laser no mesmo plano do foco do microscópio. Então, um orifício (pinhole) na frente do detector bloqueia toda luz que não vem do foco. Escaneando a amostra, obtém-se uma imagem tridimensional limpa.
Em microscópio confocal, o alinhamento é muito sensível. Se o ponto do laser, a objetiva, a óptica de coleta e o pinhole estiverem ligeiramente fora, o desempenho cai. Um microscópio multifóton contorna isso usando um comprimento de onda de laser apenas metade da energia necessária para excitar os fluoróforos. A única forma dos fluoróforos se excitarem e emitirem fluorescência é se a luz do laser for intensa o suficiente para que dois fótons atinjam o fluoróforo num tempo muito curto. Isso só acontece quando o laser é focalizado num ponto minúsculo. Assim, só o local focalizado emite luz, mantendo a imagem limpa sem luz de fundo — sem necessidade de pinhole para alinhar.
Outra forma de obter imagens muito limpas é garantir que a luz de excitação não penetre profundamente na amostra. Se um aglomerado de neurônios é colocado numa gota de solução numa lâmina de vidro, alguns neurônios aderem à superfície do vidro. Num microscópio TIRF, a luz é dirigida lateralmente no vidro para não entrar realmente na solução com as células. Mas parte da luz "vaza" minimamente na solução — bem próxima à superfície do vidro. Assim, só lugares numa região muito fina junto ao vidro emitem luz. Para neurônios, onde muito acontece na superfície celular, essa técnica é muito eficaz.
Todos os microscópios — inclusive de fluorescência — são limitados pela física da propagação da luz. Uma regra básica: um ponto focal de luz só pode ficar tão pequeno — cerca de 200 nanômetros para luz visível. Moléculas individuais têm apenas alguns nanômetros, então há características interessantes abaixo desse limite, chamado limite de difração. Cientistas desenvolvem técnicas de "super-resolução" para contorná-lo. Microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia de depleção por emissão estimulada (STED) são métodos de fluorescência que limitam o tamanho do ponto emissor de luz encolhendo o ponto de excitação.
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