O microscópio confocal gera imagens baseadas no princípio da fluorescência. Quando luz de alta intensidade, como laser, incide na amostra, esta emite luz de cor diferente. Um tubo fotomultiplicador detecta a luz emitida e envia para computador. A fluorescência pode fazer toda a amostra emitir luz, criando neblina de fundo na imagem.
A nitidez das imagens vem do conceito de pontos focais conjugados, de onde vem o nome. O microscópio tem um conjunto de lentes pelo qual a luz da amostra passa. Imagens podem se formar em diferentes pontos, mas apenas as provenientes do ponto focal da lente são nítidas. Uma tela com orifício é colocada no ponto focal da lente objetiva (ponto conjugado), bloqueando efetivamente a luz de fundo. Isso permite focar apenas na luz proveniente do ponto focal.
Microscópios confocais focam apenas um ponto da amostra por vez. O microscópio deve varrer uma série de pontos para gerar uma imagem. Ao varrer pontos em múltiplos planos, o computador reconstrói uma imagem 3D da amostra.
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