Fluxos de trabalho de clonagem molecular variam por organismo, sistema de vetor e aplicação downstream, mas o checklist abaixo cobre reagentes e hardware essenciais que a maioria dos laboratórios precisa.
Materiais Biológicos Iniciais
- DNA Fonte: DNA genômico, cDNA, produto de PCR, ou fragmento de gene sintético (gBlock, IDT).
- Cepa Hospedeira: E. coli quimicamente competente (DH5α, TOP10, NEB 5-alpha) para propagação de plasmídeo; levedura (S. cerevisiae), Bacillus, ou células de mamíferos para expressão.
Enzimas e Reagentes Centrais
- Endonucleases de Restrição: Enzimas Tipo IIP (EcoRI, BamHI, NotI, etc.) correspondentes aos sítios do MCS.
- Polimerase de DNA Alta Fidelidade: Phusion, Q5, ou KAPA HiFi para amplificação PCR com proofreading.
- T4 DNA Ligase: Formulação padrão ou quick-ligation (10 min à temp. ambiente).
- Fosfatase Alcalina (CIP/SAP): Previne auto-ligação do vetor.
- Água e Buffers Livres de DNase/RNase: 10× CutSmart, T4 Ligase Buffer, etc.
Vetores e Seleção
- Vetor de Clonagem: Plasmídeo (pUC, pBluescript), vetor de expressão (pET, pcDNA3), backbone viral (AAV, lentiviral), ou vetor shuttle.
- Marcador Selecionável: Resistência a antibiótico (AmpR, KanR, ZeoR), complementação auxotrófica, ou reporter fluorescente.
Purificação de Ácido Nucleico
- Kit Miniprep de Plasmídeo: Coluna de sílica ou beads magnéticos (Qiagen, Zymo, Macherey-Nagel).
- Kit Extração de Gel: Para recuperar fragmentos digeridos.
- Kit Limpeza PCR: Remove primers, dNTPs, polimerase.
Transformação / Transfeção
- Células Competentes: Quimicamente competentes (CaCl2/RbCl) ou eletrocompetentes.
- Eletroporador: Para transformação de alta eficiência de construtos grandes (>10 kb).
- Meio de Recuperação SOC / LB: Meio rico para recuperação pós-heat-shock ou pós-eletroporação.
Seleção e Triagem
- Placas de Ágar Seletivo: LB + antibiótico apropriado (100 µg/mL ampicilina, 50 µg/mL kanamicina, etc.).
- X-gal/IPTG: Triagem blue-white para vetores lacZα.
- Colony PCR / Digestão por Restrição / Sequenciamento Sanger: Confirme orientação e fidelidade do inserto.
Equipamentos
- Termociclador (bloco gradiente preferido)
- Microcentrífuga (14k rpm) e centrífuga de bancada (4k rpm para placas)
- Sistema de eletroforese em gel (horizontal, transiluminador UV/luz azul)
- Nanodrop / Fluorômetro Qubit para quantificação
- Incubadora/agitador (37 °C, 225 rpm)
- Freezers −20 °C / −80 °C para armazenamento de cepas
Segurança e Conformidade
- EPI: Luvas nitrílicas, jaleco, óculos de segurança.
- Conformidade Nível de Biossegurança 1/2 per protocolo CIB institucional.
- Alternativas a brometo de etídio (SYBR Safe, GelRed) para coloração de gel.
Adapte esta lista à sua estratégia de clonagem específica (Gibson Assembly, Golden Gate, TOPO, Gateway, etc.) — cada método troca algumas enzimas e componentes de buffer enquanto a infraestrutura central permanece a mesma.
